西尼羅熱病IGM檢測試劑
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西尼羅病毒IGM檢測試劑盒
- 產(chǎn)品描述
西尼羅病毒IGM檢測試劑盒
僅供科研使用
用途
美國FOCUS西尼羅河（West Nile）病毒IMM ELISA，利用了西尼羅重組抗原檢測人體血清或血漿中的西尼羅抗體。本實驗僅用于輔助診斷人感染了西尼羅病毒，不用于篩查血液或血液成分。僅供專業(yè)人員體外診斷使用。
概述
感染了西尼羅病毒會導致包括腦炎等一系列癥狀的疾病，西尼羅病毒在世界廣泛傳播，已在50多個國家檢測出該病毒。本試驗經(jīng)CDC提供的試劑檢驗與驗證。本試驗使用了一種稱為WNRA的重組抗原，它可以作為西尼羅病毒感染的快速血清學指標，WNRA蛋白是一種重組抗原，它是由含有西尼羅病毒兩個抗原的序列多肽構(gòu)成。
實驗的原理
檢測西尼羅病毒IMM ELISA 是基于兩步夾心法原理制造的。
提供的材料
1. 微孔板（96孔 12x8）：即用 每孔均包被結(jié)合西尼羅重組抗原的單抗。2－8℃下保存至保質(zhì)期。
注意：WNRA和NCA已包被于微孔板。
2. IMM樣品稀釋液：1支 25ml 即用 2-8℃下保存至使用。
3. IMM陰性質(zhì)控：1支 30ul 2-8℃下保存至使用。要長時間儲存，將其分裝于小瓶里，在-70℃下儲存。
4. IMM陽性質(zhì)控：1支 30ul 2-8℃下保存至使用。要長時間儲存，將其分裝于小瓶里，在-70℃下儲存。
5. 洗滌液（10X）：1瓶 120ml 2－8℃下保存至使用。
6. EnWash：1瓶 20ml 2－8℃下保存至使用。
7. 酶聯(lián)物：一瓶6ml 即用 2－8℃下保存至使用。
8. TMB底物液： 1支 9ml 即用 2－8℃下保存至使用。
9. 終止液；1支6ml 即用 2－8℃下保存至使用。
試劑應避免反復凍融。
操作步驟
在使用前將所有試劑和樣品平衡至室溫，并輕輕倒轉(zhuǎn)使其充分混勻。
實驗準備：
將10X的濃縮洗滌液稀釋,將120ml的濃縮洗滌液加上1080ml的蒸餾水，搖勻，至無任何沉淀，稀釋好的洗滌液zui多可在室溫下放置兩個星期。
準備實驗所需的板條，剩余的板條應盡快放入袋子里重新密封，在2－8℃下儲存至保質(zhì)期。
操作步驟
1. 標記將要使用的板條，注意微孔板已經(jīng)按照統(tǒng)一排列，如下所述包被西尼羅抗原和質(zhì)控抗原。
| 西尼羅抗原 |
| |
| 板條＃1 | 板條＃2 | |
| A | WNRA | WNRA |
| B | WNRA | WNRA |
| C | WNRA | WNRA |
| D | WNRA | WNRA |
| E | NCA | NCA |
| F | NCA | NCA |
| M | NCA | NCA |
| H | NCA | NCA |
2. 將血清樣品﹑陰性質(zhì)控和陽性質(zhì)控同樣地用樣品稀釋液按1：300稀釋。
3. 每孔加入50ul稀釋后的樣品，以下為一個血清樣品使用一個板條的*。
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| 板條1 | 板條2 | |
| 血清樣品 | |||
| A | IMM N | 樣品1 | |
| B | IMM N | 樣品1 | |
| C | IMM P | 樣品2 | |
| D | IMM P | 樣品2 | |
| E | IMM P | 樣品2 | |
| F | IMM P | 樣品2 | |
| M | IMM N | 樣品1 | |
| H | IMM N | 樣品1 | |
4. 封板，在濕潤的溫育器里37℃下溫育1小時。
5. 溫育后，用自動洗板機，使用洗滌液洗板6次。
6. 在每孔中加入50ul的酶聯(lián)物。
7. 封板，在濕潤的溫育器里37℃下溫育1小時。
8. 溫育后，用自動洗板機，使用洗滌液洗板6次。
9. 每孔加入150ul的EnWash，在室溫下溫育5分鐘
10. 溫育后，用自動洗板機，使用洗滌液洗板6次。
11. 每孔加入75ul的TMB底物液。
12. 封板，在室溫下，避光處溫育10分鐘。
13. 每孔加入50ul的終止液終止反應。
14. 在450nm處讀取吸光率。
結(jié)果的計算
結(jié)果的變化將會非常大，以下結(jié)果僅供指引。
計算ISR值：
計算在同一實驗里WNR抗原的兩個陰性質(zhì)控的平均值，計算同一實驗里NC抗原的兩個陰性質(zhì)控的平均值，用WNRA/NCA，得出陰性質(zhì)控的ISR值。同樣地計算陽性質(zhì)控和樣品得ISR值，陽性質(zhì)控的ISR值應高于3.0，陰性質(zhì)控的ISR值應低于1.5。
| ISR | 結(jié)果 | 解釋 |
| ≤2.0 | 陰性 | 沒有檢測到IMM抗體 |
| 2.0－3.0 | 可疑 | 需確證實驗 |
| ≥3.0 | 陽性 | 存在IMM抗體，建議做確定性實驗 |
結(jié)果的判斷：
在某些特殊的例子中，曾報道有假陽性，但對梅毒病人無限制。假如樣品的ISR值大于2.0，但是WNRA和NCA的OD值均偏低，可視為潛在假陽性。以下為樣品1排除標準的范例。
排除標準：
計算陰性質(zhì)控的WNRA和NCA值：
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| WNRA | NCA |
|
| 0.153 | 0.126 |
| NO.2 | 0.125 | 0.110 |
| 總計 | 0.260 | 0.236 |
平均WNRA=0.260/2=0.130
NCA=0.236/2=0.118
ISR=0.130/0.118=1.10
任何陰性質(zhì)控的ISR值高于1.5，則實驗需要重做。
計算陽性質(zhì)控的WNRA和NCA值：
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| WNRA | NCA |
|
| 0.635 | 0.190 |
| NO.2 | 0.655 | 0.178 |
| 總計 | 1.290 | 0.368 |
平均WNRA=1.290/2=0.645
NCA=0.368/2=0.184
ISR=0.645/0.184=3.5
任何陽性質(zhì)控的ISR值低于3.0，則實驗需要重做。
以下標準是必需遵守的，不滿足以下標準，試劑出現(xiàn)了質(zhì)量問題或操作錯誤，實驗需重做。
| 因素 | 范圍 |
| 平均陰性質(zhì)控讀數(shù) | ＜0.400 |
| 平均陽性質(zhì)控讀數(shù) | ＞0.400 |
| 陽性質(zhì)控的ISR值 | ＞3.000 |
| 陰性質(zhì)控的ISR值 | ＜1.500 |
解釋結(jié)果
1. 樣品的ISR值大于3.0視為陽性。
2. 陽性結(jié)果需重做證明。
3. 樣品的ISR值小于2.0視為陰性。
4. 樣品的ISR值小于3.0但是大于2.0，視為未確定，但是很有可能陽性，實驗需一式三份重做。
5. ISR值大于2.0是因為WNRA和NCA的值都低造成的，應該視為潛在假陽性。
樣品1低OD值的范例：
計算樣品的WNRA和NCA值：
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| WNRA | NCA |
|
| 0.044 | 0.190 |
| NO.2 | 0.016 | 0.007 |
| 總計 | 0.060 | 0.026 |
平均WNRA=0.060/2=0.030
NCA=0.026/2=0.013
ISR=0.030/0.013=2.31
雖然樣品的ISR值高于2.0，但是本樣品需視為假陽性，因為其OD值低，而且遠遠偏離了相關的標準品，這通常在空白值高的情況下發(fā)生。
要進一步證實樣品，所有陽性的結(jié)果都要用6，2層析稀釋滴定法重做，與相同滴定法的陰性質(zhì)控相比較，假如曲線是？？的，平的或者是波浪型的曲線，則表明為假陽性的結(jié)果。
實驗的局限性
1. 樣品的OD值高于抗原質(zhì)控（非WNRA）,導致ISR值小于3.0，則可能為假陰性，再釋稀樣品重新實驗，可能會獲得真正的ISR值。
2. 既然這不是一個直接檢測的方法，則需考慮假陽性和假陰性存在的可能性。
3. 所有有反應的樣品，應用確定性實驗來證實。
4. 本實驗提供的試劑，盡可能地檢測血清或血漿中的WNRA反應性抗體水平。
5. 應避免反復凍融樣品和試劑。
6. 不要使用溶血或脂血的樣品，它們會導致錯誤的結(jié)果。
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